CBD 抑制 SARS-CoV-2 复制并促进宿主先天免疫反应

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当从其来源植物中分离出来时，天然非合成 CBD 通常与其他大麻素一起提取，代表了天然产物不可避免的残留复杂性。为了验证 CBD 确实对病毒抑制负责，我们使用 100% 定量 NMR (qNMR) 分析了 CBD 参考标准以及来自三个不同来源的 CBD 纯度。这些来源包括两个化学品供应商（供应商 A 和 B）和一个使用天然材料的商业供应商（供应商 C）。对所有材料观察到的实验 1H NMR 和最近建立的量子力学 HiFSA（1H 迭代全自旋分析）曲线之间惊人的一致性证实：1）所使用的化合物确实是 CBD，纯度至少为 97%（图 1B） 2) 同类大麻素含量不超过 1.0% ( )。在病毒 A549-ACE2 感染试验中对这些不同 CBD 制剂的分析显示出相似的 EC50，范围为 0.6-1.8 μM，可能反映了该试验的内在生物学变异性（图 1C）。在用于抑制病毒感染的剂量下，没有观察到任何 CBD 制剂的毒性（图 S1 E-G）。 CBD 通常作为 C. sativa 提取物的一部分食用，特别是与富含大麻植物的精神活性 THC 结合使用。因此，我们确定了同类大麻素，尤其是由大麻植物产生的具有密切相关结构和极性的类似物，是否也能够抑制 SARS-CoV-2 感染。值得注意的是，只有 CBD 是一种有效的药物，而结构密切相关的同源物表现出有限的或没有抗病毒活性，这些同源物共享生物合成途径并形成从 C. sativa 中纯化的 CBD 的生物遗传决定的残留复杂性：THC、大麻二酚酸 (CBDA)、大麻二酚 (CBDV)、大麻二酚 (CBC) 或大麻酚 (CBG)（图 2 A-B；参见方法）。在感兴趣的剂量范围内，这些化合物对 A549-ACE2 细胞均无毒性（图 S2）。值得注意的是，将 CBD 与 THC (1:1) 结合使用可显着抑制 CBD 功效，这与 THC 的竞争性抑制一致。 CBD 在肝脏和肠道中迅速代谢为两种主要代谢物，即 7-羧基大麻二酚 (7-COOH-CBD) 和 7-羟基大麻二酚 (7-OH-CBD)。尽管人血浆中 7-COOH-CBD 的水平比 7-OH-CBD 高 40 倍，但 7-OHCBD 是治疗癫痫的有效成分。与 CBD 一样，但与其他大麻素不同的是，7-OH-CBD 有效抑制了 A549-ACE2 细胞中的 SARS-CoV-2 复制（EC50 3.6 μM；图 2C）并且对细胞无毒（图 S2H）。对服用 FDA 批准的 CBD (Epidiolex®) 的健康患者血浆水平的分析显示，CBD 的最大浓度 (C max) 在 nM 范围内，而 7-OH-CBD 的 C max 在 μM 范围内，与观察到的相似在培养细胞中 (15)。这些结果表明 CBD 本身的存在水平不足以有效抑制人类 SARS-CoV-2。相比之下，其代谢物 7-OH-CBD 的血浆浓度，通过将 CBD 与高脂肪膳食共同给药，其 C max 可以增加几倍，足以潜在地抑制人类的 SARS-CoV-2 感染( 15). CBD 可能会阻止病毒进入宿主细胞或在感染后的后续步骤中起作用。由于 CBD 显示降低包括 A549 在内的一些上皮细胞中 ACE2 的表达，我们首先确定 CBD 是否抑制了我们的 A549-ACE2 过表达细胞中的 SARS-CoV-2 受体。没有观察到 ACE2 表达的减少（图 3A）。此外，对 SARS-CoV-2 刺突蛋白或 VSV 糖蛋白（然而，10 μM C​​BD 仅部分抑制了表达刺突病毒的细胞进入，这表明其他机制在很大程度上决定了其抗病毒作用（图 3B，以及图 S3 A 和 B）。相比之下，刺突蛋白的抗体有效地阻止了 SARS-CoV-2 的病毒感染，但不能阻止表达 VSV-G 的病毒。与此一致，即使在感染后 2 小时，在刺突蛋白抗体存在的情况下，CBD 也能有效抑制宿主细胞中 SARS-CoV-2 刺突蛋白的表达，以防止在此期间再次感染（图 3C、 、D ）。 D)。为了评估 CBD 是否可能阻止病毒蛋白酶 Mpro 或 PLpro 对病毒蛋白的加工，我们在体外测定了它们的活性（图 S4）。 CBD 不影响任一蛋白酶的活性，提高了 CBD 靶向宿主细胞过程的可能性。与此解释一致，对用 CBD 处理 24 小时的受感染 A549-ACE2 细胞进行的 RNA-seq 分析显示，SARS-CoV-2 诱导的基因表达变化受到显着抑制。 CBD 有效地消除了宿主细胞中的病毒 RNA 表达，包括编码刺突、膜、包膜和核衣壳蛋白的 RNA（图 4A 和 B）。 B)。 SARS-CoV-2 和 CBD 都诱导了细胞基因表达的显着变化，包括许多转录因子（图 S5 和 S6）。宿主细胞 RNA 的主成分分析显示病毒变化几乎完全逆转，但 CBD + 病毒感染的细胞与单独用 CBD 处理的细胞相似（图 4C）。使用 Metascape 的聚类分析揭示了一些有趣的模式和相关主题（图 4D、图 S7 和 S8）。例如，与染色质修饰和转录相关的基因（簇 1）的病毒诱导被 CBD 逆转，尽管单独的 CBD 没有影响。同样，与核糖体和中性粒细胞（第 3 类）相关基因的病毒抑制在很大程度上被 CBD 逆转，但单独使用该药物没有效果。这与簇 5 和簇 6 形成对比，其中 CBD 单独诱导与宿主应激反应相关的基因的强烈激活。这些结果共同表明 CBD 可以防止病毒蛋白翻译和相关的细胞变化。 CBD 抑制病毒感染和促进病毒 RNA 降解的一种潜在机制是通过诱导干扰素信号通路。干扰素是对病原体暴露最早的先天免疫宿主反应之一。 SARS-CoV-2 感染会抑制干扰素信号通路 ( )（图 5A 和图 S9）。在病毒不存在和存在的情况下由 CBD 诱导的一些基因包括干扰素 β 和 γ 的受体以及信号通路的介质，例如 STATs 1 和 2（图 5A 和图 S10）。途径中的其他基因，如 OAS1，一种干扰素诱导的基因，可导致 RNase L 的激活和 RNA 降解（ ），除非存在病毒，否则不会被 CBD 显着诱导（图 5A 和图 S11）。后者的这些结果与 CBD 降低有效病毒滴度足以使干扰素途径正常宿主激活的可能性一致。同时，CBD 有效地逆转了病毒诱导的细胞因子，这些细胞因子可在感染后期导致致命的细胞因子风暴（图 5B）。总的来说，这些结果表明 CBD 抑制 SARS-CoV-2 感染部分是通过激活干扰素途径导致病毒 RNA 降解和随后病毒诱导的宿主基因表达变化，包括细胞因子。鉴于含有大量 CBD 的 CBD 制剂被大量个人服用，我们检查了 CBD 暴露是否可能与 SARS-CoV-2 感染风险降低有关。对芝加哥大学医学中心超过 93,000 名接受 SARS-CoV-2 检测的患者的分析表明，10.0% 的患者总体检测呈阳性，但在约 400 名病历中有任何大麻素的患者中，只有 5.7% 检测呈阳性（图 6） .与其他大麻素相比，服用 CBD 的患者的检测阳性率更低（85 名 CBD 患者为 1.2%，而服用其他大麻素的 113 名患者为 7.1%，p=0.08）。服用其他大麻素的患者对病毒感染的保护较少的这一发现与我们的细胞培养研究一致。由于多个潜在的混杂因素可以解释这些发现，包括年龄、种族、临床发病率和性别，我们将 82 名在 COVID-19 测试前接受了 FDA 批准的口服 CBD（Epidiolex®）处方的患者与没有任何迹象的患者进行了匹配在 COVID-19 测试前的两年内服用任何大麻素，但具有类似的其他特征，包括类似的人口统计学特征、临床合并症和其他药物的记录（表 S1）。在 COVID-19 测试前服用口服 CBD 的患者中，最常见的发病类别是高血压和免疫抑制疾病。引人注目的是，只有 1.2% 的 CBD 患者感染了 SARS-CoV-2，而匹配的非大麻素患者中有 12.2% 检测呈阳性（p = 0.009），这表明 SARS-CoV-2 感染风险可能降低约数量级。

我们的研究结果表明，CBD 可以在感染的早期阶段阻止 SARS-CoV-2 感染，并且 CBD 给药与人类感染 SARS-CoV-2 的风险较低有关。此外，患者体内的活性化合物很可能是 7-OH-CBD，与 CBD 治疗癫痫的代谢物相同。服用 FDA 批准的 CBD 的患者的 SARS-CoV-2 感染风险显着降低了大约一个数量级，这凸显了该药物在对抗 SARS-CoV-2 感染方面的潜在功效。最后，CBD 抑制 MHV 复制的能力增加了 CBD 可能对未来出现的新致病病毒有效的可能性。促进 CBD 抗病毒活性的一种机制是在宿主对病毒病原体的免疫反应激活后直接和间接诱导干扰素途径。事实上，干扰素已被临床测试为 COVID-19 的潜在治疗方法（ ）。重要的是，CBD 还抑制细胞因子激活以应对病毒感染，从而降低免疫细胞募集和随后肺和其他受影响组织内细胞因子风暴的可能性。这些结果补充了之前的发现，表明 CBD 抑制了募集的免疫细胞（如巨噬细胞）中细胞因子的产生。因此，CBD 不仅可以在感染的早期阶段充当抗病毒剂，而且还可以在后期保护宿主免受过度活跃的免疫系统的侵害。 CBD 作为 SARS-CoV-2 的潜在预防剂具有许多优势。如果 THC 的含量小于 0.3%，CBD 可以广泛使用而不受限制访问。有多种摄入方式，包括吸入和鼻腔给药的可能性。 CBD 在进入细胞后阻止病毒复制，因此可能对具有突变刺突蛋白的病毒变体有效。与瑞德西韦或抗病毒抗体等药物不同，CBD 给药不需要在医院环境中注射。最后，CBD 仅与轻微的副作用相关 (15)。但是，在考虑甚至探索 CBD 作为 COVID-19 的治疗方法之前，需要仔细检查几个问题。尽管市场上有许多 CBD 制剂，但它们在质量、CBD 的量和口服后的药代动力学特性方面差异很大，而这些大多是未知的。 CBD 非常疏水并形成大的胶束结构，这些结构在肝脏中被捕获和分解，从而限制了口服后其他组织可用的药物量。非活性载体对临床可获得的浓度有显着影响。由于 CBD 作为食用油中的制剂广泛销售，我们分析了调味商业大麻油，发现代表性样品中的 CBD 含量仅为 0.30%（图 S12）。 CBD 的纯度，特别是标记为 CBD 的材料的成分也很重要，特别是鉴于我们的研究结果表明其他大麻素（如 THC）可能会对抗 CBD 的抗病毒功效。除了与其法律地位相关的问题外，这基本上消除了大麻作为抗病毒 CBD 的有效来源的可行性。最后，其他 CBD 管理方式（例如电子烟和吸烟）引发了对潜在肺损伤的担忧。未来的研究将需要探索向患者提供 CBD 的最佳方式以及临床试验，以充分测试 CBD 作为阻断 SARS-CoV-2 感染的治疗剂的前景。由于血浆中 CBD 的清除率在人类中远低于小鼠，我们建议转向临床试验，而不是在动物模型中进行临床前研究 (15)。我们提倡精心设计、具有已知浓度和高度特征化配方的安慰剂对照临床试验，以确定 CBD 在预防和治疗早期 SARS-CoV-2 感染中的作用。必要的人体体内浓度以及最佳途径和配方仍有待确定。我们强烈警告不要在目前可用的配方中使用 CBD 作为预防或治疗疗法，尤其是在不了解这种天然产品的严格随机临床试验的情况下（）。我们感谢芝加哥 SARS-CoV-2 宿主响应小组的成员激发讨论和支持，特别感谢 Julian Solway、Rick Morimoto、Nissim Hay、Anne Sperling、HuanHuan Chen、Raphael Lee、Raymond Roos、Shannon Elf、Alexander缪尔、高汗穆特鲁、杰伊平托、史蒂文怀特、尼古拉杜林、雷默勒林、维斯瓦......