一头CRISPR小牛诞生了。绝对是个男孩

小牛迟到了。他的预产期3月30日来了又去了。起初，艾莉森·范·埃南纳姆(Alison Van Eenennaam)将其归因于雄性小牛往往会迟到一两天。随着一周的时间过去，这位动物遗传学家提醒自己，经过基因编辑的胚胎-比如过去9个月一直生长在奶牛3113体内的胚胎-可能需要更长的时间才能向它们的代孕母亲发出信号，表明它们已经准备好出生了。但到了接下来的一周，加州大学戴维斯分校牛棚的两次错误警报，在仍然没有分娩即将到来的迹象的情况下，范·埃南纳姆日益紧张的神经已经受够了。她给兽医打了电话。该是诱导的时候了。

经过近五年的研究，至少50万美元的投入，数十次失败的怀孕，以及无数的科学挫折，范·埃南纳姆创造出一种适合牛肉行业需求的Crispr牛系列的开创性尝试最终都归结为这头小牛。幸运的是，他即将在一场全球大流行中进入这个世界。

就在几周前，加州州长命令整个州呆在家里，以避免传播一种致命的新型冠状病毒。这是在发现美国第一例社区传播病例之后。患者在加州大学戴维斯分校医疗中心接受治疗，距离牛舍约20英里。旧金山湾区的ICU床位人满为患。Van Eenennaam担心如果分娩向南，他们需要做剖腹产会发生什么；兽医被要求保存他们的镇静剂，以帮助满足日益增长的对使用呼吸机的(人类)新冠肺炎患者的需求。似乎这还不够不祥，当天赶到监督分娩的兽医住院医生整个早上都在放倒加州大学戴维斯分校羊群中的一些羊，这些羊在晚上被郊狼撕裂了。

“考虑到这个项目的进展情况，这个项目的结局真的不可能有太大的不同，”范·埃尼纳姆说，她的澳大利亚语气中夹杂着不安的讽刺意味。“这就像是启示录中的三位骑手可能会紧随其后。”

事实并非如此。小牛当天下午到了，重达110磅，乌黑的，除了后蹄上方掠过脚踝的白色飞溅。两名兽医不得不用铁链把他从3113号奶牛身上救出来，但当他被放到稻草覆盖的畜栏院子里时，他还活着，还在呼吸。“宇宙啊，”范·埃南纳姆会得意洋洋地喊道。“欢迎来到这个世界，小家伙！”

天空没有变暗，世界也没有末日。但是，尽管黑牛犊又大又壮，而且很健康，但它并不是科学家们希望创造的。仔细观察他的DNA将揭示Crispr基因编辑有多么不可预测，以及在这项技术成为动物繁殖的常规做法之前，科学家们还需要了解多少。

乔伊·欧文从来没有真正喜欢过动物。在2014年进入Van Eenennaam的牲畜实验室之前，他曾学习过生物化学，然后是癌症遗传学。对于像他们这样的科学家来说，这是一个充满希望的时代。CRISPR的基因组工程潜力在两年前才被发现。它开启了创造设计师驯养动物的可能性，而不需要将基因从一个物种转移到另一个物种。较旧的基因工程技术依赖于使用病毒和细菌运送DNA，这引发了美国监管机构昂贵而漫长的审批过程。因此，到目前为止，美国农民和牧场主只能依靠缓慢的选择性育种来改善他们牛群和羊群的基因。CRISPR承诺改变这一点。

Van Eenennaam将目光投向了牛和一种名为SRY的基因-Y染色体上的一段很长的伸展，指示哺乳动物胚胎发展男性特征。在自然界中，牛(和人)生下雄性(XY)或雌性(XX)后代的几率是相等的。但如果她能使用Crispr将SRY的副本添加到牛胚胎的X染色体上，那么她就可以扭转机会，产生一个全是男性的牛群。任何带有SRY基因的动物在生理上都是雄性的，即使是那些基因为XX的动物也是如此。无论如何，这就是她想要检验的假设。以前从来没有人做过这件事。

在喜欢牛更大更肉的牛肉行业，更多的雄性意味着更多的钱意味着更好的。由于雄性小牛比雌性更有效地增加体重，农民可以用更少的动物生产同样数量的肉类-潜在地减少了该行业的全球变暖排放。如果Van Eenennaam能够证明这一概念，那可能会为创造其他单一性别物种铺平道路-全是雌性的下蛋鸡群和奶牛群-最终，她觉得，一个不那么残酷的工业化食品生产系统。

但她和欧文向美国农业部推销的实验雄心勃勃，令人难以置信。这将需要在牛胚胎中插入非常大的DNA块。当他们向美国农业部申请生物技术风险评估拨款时，使用Crispr的类似编辑以前只在奶牛细胞中进行过两次，而且从未在胚胎中进行过。尽管如此，该机构还是向他们发放了价值50万美元的为期5年的拨款。“当美国农业部资助我们的项目时，我们的反应是，‘等等，真的吗？’”欧文回忆道。从一开始，几乎没有任何事情按计划进行。

第一步是试图让Crispr对牛胚胎进行他们想要的编辑。CRISPR本质上是一把可编程的分子手术刀。它的工作原理是以基因组中的特定位置为目标，切开DNA的双螺旋骨架。然后由细胞自身的修复机制将断裂的DNA缝合在一起。如果你想在这些松散的末端之间添加新的遗传密码，诀窍是滑动细胞的“模板DNA”-在这种情况下是SRY基因的副本-以及Crispr成分。

这种方法在活跃分裂的细胞中效果最好。正如欧文很快发现的那样，单细胞胚胎就没有那么多了。“我们把所有东西都扔到墙上，看看有什么能粘住，”他说。“什么都没有。”

因此，他们用了一种更古老、更不受欢迎的方法重新开始-编辑牛细胞，然后将它们的DNA克隆到卵子中。(大约在同一时间，中国的一个研究小组成功地利用这项技术将一种抗结核病的基因克隆到牛身上。)。为了使这一过程更容易，欧文在SRY基因的同时添加了绿色荧光蛋白(GFP)基因。这将使他能够直观地看到哪些细胞成功地将男性的遗传配方插入到了X染色体上。然后他注意到了一些奇怪的事情。那些确实整合了新DNA的细胞，那些发光的细胞，都停止了分裂。编辑阻止了他们的发展。

当他们开始实验时，研究人员已经锁定了X染色体的一部分，它似乎在一段垃圾DNA内，远离任何对生命至关重要的基因。但他们当时唯一可以获得的牛基因组图谱是十多年前绘制的一幅粗糙的肖像。2018年春季发布的一份更新的牛基因组显示，欧文的团队没有像预期的那样将SRY基因10000个碱基对插入细胞生长所必需的基因之外，而是将其插入了中间。

他们回去重新设计了他们的Crispr系统，使用更新后的地图来引导他们的编辑避开任何必要的基因。然后他们又用胚胎进行了试验。这一次，它奏效了。但现在已经是2018年夏天了，将近三年过去了。这个项目远远落后于计划。他们不得不要求美国农业部延长他们的拨款。漫长的一系列挫折让欧文感到相当沮丧，他希望自己从来没有在克里斯普林牛身上尝试过。他最近成功地在一个新的X染色体位置编辑了胚胎，这让他重新焕发了活力，但这种感觉是短暂的。他们将第一批经过编辑的胚胎移植到准代孕小母牛的子宫中，但没有接受。在下一批中，有5个胚胎被植入并成功进入怀孕早期，但在几周后就丢失了。

Owen和Van Eenennaam咨询了饲养员和兽医，看看他们做错了什么。他们怀疑研究人员在实验室里损坏了胚胎-可能是在活组织检查期间，当时他们取出了一小部分胚胎进行测序，并确定编辑是否站稳了脚跟。这样做需要时间，需要冷冻胚胎，直到测序实验室的结果出来。每一步--冷冻、活组织检查、编辑--都会降低胚胎的存活率。

有一种更简单的方法可以做到这一点。他们可以再次连接产生荧光的基因，并将一束紫外线照射到胚胎上。绿光会告诉他们编辑成功了，不需要活组织检查或冷冻。但这将使这些动物获得转基因；绿色荧光蛋白来自一种生活在华盛顿州附近水域的生物发光水母。这将使它们成为转基因生物，或称转基因生物，受到FDA艰难的审批程序的约束。该项目和使用Crispr的全部意义在于避免这种情况。

然而，在他们修修补补的同时，监管格局已经发生了变化。2017年1月，FDA决定对任何编辑过的动物DNA进行分类，就像它是一种新的药物一样。这意味着任何全是雄性的Crispr牛群将受到与第一代转基因生物相同的监管。研究小组认为，如果在联邦政府看来，移动奶牛DNA与添加水母基因是一样的，为什么不让他们的生活变得更容易一些呢？由于几乎没有希望任何牛饲养者或商业实体会对他们的SRY敲门事件足够感兴趣，以至于费心与联邦政府纠缠在一起，研究人员不妨也继续进行发光基因的研究。

Van Eenennaam和Owen进行了最后一次尝试，将SRY基因和发光基因一起移植到大约200个胚胎中。由于这是他们的最后一针，他们决定不像他们一直试图做的那样，在X染色体上进行编辑，而是在17号染色体上一个公认的安全港位置进行编辑。22个胚胎在这个过程中存活了下来，其中9个在紫外光下闪烁。但欧文说，它们中只有一只全身是亮绿色的。在所有胚胎都被移植到小母牛一个月后，那个亮绿色的是唯一存活下来的妊娠。研究小组决定将成长中的小牛犊命名为Cosmo，以2000年代中期播出的动画片Nickelodeon电视剧“相当古怪的父母”(The Right OddParents)中一个发光的绿色角色的名字命名。Van Eenennaam说：“我显然太像婴儿潮一代了，因为我从来没有听说过它。”

超声波显示科斯莫是一名男性。当他在4月7日出生时，这是兽医在确保小牛还在呼吸后进行的第二项检查。“是的，他有睾丸--两个！”他告诉范·埃南纳姆和欧文。“表型雄性，这是一个很好的开始！”

但要知道他是否因为Crispr而有这些男性部分，就需要窥视Cosmo的DNA。研究小组从小牛的脖子上抽取了几瓶血，欧文迅速将其送到实验室，并将其放入冰箱，开始了16小时的降温。他回到家，喝了几杯啤酒来平息急躁的焦虑，并把他的闹钟定在第二天早上6：30。凌晨5点，他突然醒来，趁着天还没亮就匆匆赶回实验室。欧文从小牛的血液中提取DNA，并使用一种名为PCR凝胶电泳的技术来寻找额外的SRY和GFP基因的存在。大约四个小时后，当乐队恰好出现在预期的地方时，一种欣喜若狂的震撼传遍了他的身体。“我靠，你真的这么做了！”他心想。

欧文环顾四周，在寂静的乐器中领略了这一刻。由于大流行，实验室一次只允许一个人进入；他的同事们都在家里避难。所以他拍了一张凝胶的照片，并给团队发了电子邮件。

在她卧室斜杠的家庭办公室里，范·埃南纳姆点击了这封电子邮件，准备好迎接更多的坏消息。取而代之的是，胜利冲刷着她。“耶！”她回忆说，她用拳头抽打空气，大声喊道。

凝胶结果并不完全是一支全垒打。它揭示了Cosmo是XY，这意味着他从他的亲生公牛父亲那里继承了SRY的副本，以及欧文将SRY基因克隆到他的第17条染色体上。即使没有剪辑，他也一直是个男性。但是，这种敲入技术奏效了，有史以来第一次在牛胚胎中使用了Crispr。“得到这个结果真的很酷，”Van Eenennaam说。“这实际上是有史以来最棒的科学日之一。”

但在第一次快速扫描Cosmo的DNA时，还显示了一些其他的东西。这是一段遗传密码，它不属于奶牛或水母，而属于细菌。为了将如此大的基因-SRY是几千个DNA字母-插入到后来成为Cosmo的单细胞胚胎中，欧文不得不以科学家知道的唯一方式将其送入细胞：在一段被称为质粒的圆形细菌DNA中。在Crispr完成切割后，Cosmo的修复酶抓住了质粒和SRY基因，并将整个片段粘贴到他的基因组中。

这种错误以前也发生过。去年，在明尼苏达州生物技术公司Recombinetics使用克隆和编辑细胞变成鸡蛋的方法创造的一对基因脱角公牛中发现了类似的质粒。Van Eenennaam从美国农业部获得了资金，用于研究Recombinetics的公牛及其后代，看看这种基因改变是否如预期的那样遗传。这个质粒是由FDA的一名科学家在分析他们的一些后代的DNA序列数据后发现的，此前Van Eenennaam向该机构请愿，要求获得监管豁免，以便加州大学戴维斯分校生产的动物可以在当地屠宰和出售。

“重组生物学”的科学家们从来没有费心去寻找质粒的存在。虽然这种细菌DNA还没有被证明对动物或它们的肉类产生任何不良影响，但在许多国家，它确实将它们重新定义为转基因生物，使它们受到更严格的监管审查。这一消息破坏了该公司在巴西用一头公牛的精液培养创始人群体的计划。这对规模虽小但不断增长的牲畜编辑业是一个巨大的打击。

但它成功地提高了人们对这些潜在问题的认识。因此，范·埃南纳姆的团队已经提前计划对宇宙的DNA进行深入研究。这一点也因大流行而变得复杂。加州大学戴维斯分校的测序核心被关闭了。因此，研究小组将科斯莫的血液、组织和胎盘送到两家不同的公司，以拼凑出他的真实构成。他们得到的结果比他们预想的还要奇怪。

CRISPR已经完成了它应该削减的开支。但后来它又赚了更多的钱。因此，在Van Eenenaam和Owen原本打算粘贴SRY和GFP各一份的地方，情况变得更加混乱。在17号染色体的一条手臂上，新的DNA根本没有携带。细胞随机抓取26个DNA字母来填补缺口。(对于细胞修复双链DNA断裂来说，这是相当正常的)。真正的行动发生在另一只手臂上。在大约90%的细胞中，已经有7个SRY和GFP拷贝被插入。其中两个是向后插入的。细菌质粒也在里面。在大约10%的细胞中，存在三个(定向正确的)SRY-GFP结构副本和一个质粒。

不管你怎么拼接，那是很大的SRY。另外，科斯莫的Y染色体上也有他从父亲那里继承来的那一份。“他是一个非常有男子气概的人，”范·埃南纳姆说。她说，这些重复并不是他们的本意，但到目前为止，它们似乎并没有对Cosmo有害。“他存在的事实告诉我，拥有比你需要的更多的SRY拷贝并不会杀死你，”她说。

对携带额外SRY拷贝的小鼠的研究没有发现任何证据表明这种突变会伤害动物，尽管它会导致XX个人不育。尽管如此，当谈到基因编辑的风险时，Cosmo的SRY堆积恰恰是Crispr批评者担心的那种不可预见的后果。近年来，国外其他旨在将名牌农场动物推向市场的实验也出现了奇怪的副作用，包括兔子的舌头增大，脊椎额外发育的猪，以及牛的过早死亡。哈佛医学院的动物生物伦理学家丽莎·摩西(Lisa Mosse)在这类报道发表时告诉“华尔街日报”，“我们认为自己知道自己在做什么，可以预测可能发生的坏事，这真是傲慢。”

加州大学伯克利分校创新基因组研究所的基因编辑专家Fyodor Urnov没有参与加州大学戴维斯分校的工作，他说，指望像Van Eenennaam这样的开创性实验一开始就完美无缺是不现实的。“他们试图通过在胚胎中使用基因编辑进行定向整合来制造公牛，事实上他们成功了，”他说。这是一次原始的剪辑吗？不是的。这是否意味着这个领域注定要完蛋了？他说，绝对不会。“有办法克服这些问题，但在你知道它们存在之前，你无法解决它们。”

这将需要数年的仔细研究才能确切地了解所有SRY的真正影响是什么。但加州大学戴维斯分校的团队在周四上午美国动物科学学会的海报展示上公开了他们对宇宙的基因组的初步分析。堪培拉澳大利亚国立大学(Australian National University)的遗传学家盖坦·伯吉奥(Gaétan Burgio)审查了这一结果，他说，他对这个不太完美的结果并不感到惊讶。他的团队经常使用Crispr将新基因添加到老鼠DNA中，以制造研究人类疾病的新模型。他说，多拷贝和不需要的质粒插入非常典型。“我们在老鼠身上已经看到了很多这样的情况，”他说。有时细胞会合并细菌DNA的多个拷贝。Burgio已经在一只动物身上看到了多达70只。“用Crispr来敲门绝对是一场噩梦，”他说。

他说，混乱都可以归结为基因编辑酶的动力学。任何时候你把DNA一分为二，结果都很难控制。但在Crispr基因编辑研究的早期，当Van Eenennaam开始她的全雄性牛项目时，科学家们并不真正知道这一点。Burgio说，直到2017年底左右，关于错误插入和其他不良改变的报告才开始在老鼠身上出现。

一些较新的Crispr构造仅通过擦除DNA来避免此类错误，从而限制了不需要的插入的机会。但这些系统通常在其他方面变化无常-它们可能只在一小部分单元格中工作，或者进行其他类型的脚本外编辑。“底线是：没有完美的工具，”Burgio说。加州大学戴维斯分校团队的牛实验的设计和分析在他看来是合理的。然而，这进一步证明，利用Crispr来重新设计牲畜DNA仍然是一门非常新的科学。“现在我们很擅长让动物的基因编辑变得高效，但我们还不擅长让它变得安全。我想我们会到那里的。但我们还有相当多的工作要做。“他说。

对于Van Eenennaam来说，这项工作将包括将Cosmo提高到生殖成熟，明年春天收集他的精液，并试图生产下一代小牛。理论上，他应该产生75%的男性后代-正常的50%将继承他的Y染色体，另外25%将获得SRY基因Crispr进入他的第17条染色体。Van Eenennaam希望研究这些拷贝是否足以启动发育程序，使染色体上的雌性动物看起来和行为(以及体重增加)都像雄性动物一样。她将不得不申请新的拨款来进行这些下一步的实验。

这将只是一项纯粹的研究；甚至在质粒出现之前，Cosmo的水母基因就已经确定了这一点。尼思。

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